什么是CT值比较法？数据怎么处理？CT值与起始DNA浓度的对数成反比：如果：不同管之间的PCR反应效率相同。这些PCR的反应效率接近100%。可以从上面的公式推出相对含量（X01/X02）=2-ΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件较接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。qPCR 是分子生物学中的常规实验。山西SYBRGreen法qPCR机构
完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：GC含量30%～80%，C碱基要多于G碱基，长度一般15～30bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G碱基。G碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般优先常规的 FAM 和 HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团。天津相对定量qPCR公司哪家好SYBR green染料法相对较便宜。
扩增子是发生PCR反应的靶标基因片段。由于qPCR只是用于表征靶标基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：扩增子长度一般在75～200bp范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。尽可能避免产生二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单。尽可能避免了单碱基连续重复超过4次（如AAAA、CCCC等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。GC含量尽可能在50%～60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高GC模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。
RNA模板的质量评估也是必不可少的，专有例外当提取的总RNA质量太低以至于不能评价质量时。这种情况一般发生在从单一细胞、血浆或其它体液中提取RNA，以及一些激光捕获样本或者组织培养收集的样本提取RNA时。这种情况同样适用于RT-qPCR持续单管试验。需要报道RNA数量，融合和没有反转录或PCR抑制剂等关键信息。应该记住体内RNA降解是由于mRNA因自然刺激的自然调节。RNA降解是研究人员无法控制的，其表现之一是高质量的RNA样本可以表现单个mRNAs的不同降解。A260/A280比值必须在中性PH值buffer中测量，但是这个比值如果于核酸用于定量分析，尤其是目的是为了测量细胞mRNA浓度的微小差异(＜10倍)时，这个比值不够用。吸收度比值提供了RNA纯度指标，因为DN或者残余苯酚可以改变这个比率。因此至少应该提供凝胶电泳证据，或者更好能提供微流控芯片的rRNA分析结果，或者一个参考基因/靶基因3’:5’完整性检测。上海SYBRGreen法qPCR机构哪家好？
想做好qPCR，show出漂亮的结果，纠正不良的qPCR操作习惯，需要准备以下内容（以染料掺入法为例子）。1.设计目的基因引物。请参考以上内容，上海英俊默认是2OD，实际上2OD~5OD的价格是一样的，5OD做几千个样品是没问题的，我每次都是设计5OD，1OD/管，每次只溶解1管，其余4管冻存-80，理论上管用n年2.设计内参基因引物。这很重要，不同组织选择内参基因种类不同，常见内参有HPRT、ACTIN、UBC、UBB等等，不要人云亦云，自己去找文献看看目的组织内哪种内参较稳定，有钱的，需要数据可靠性高的，可以选择2种引物，更高大上的可以做3种及以上，然后利用qbaseplus选择较稳定的引物。3.准备一瓶灭菌超纯水用来稀释引物。虽然以前都说用TE缓冲液，但是qPCR还是用纯水的好，加多少水到10umol都是告诉你的，请自觉寻找。4.在A工作区域内分装引物，加入灭菌水后，摇晃-10000rpm1分钟-分装40ul/管，我每次都是把上下游引物混在一起分装，这样比较方便，冻存后，每次用之前冰上溶解。5.在B工作区域内准备模版，cDNA或者DNA，总之，1ugRNA，经逆转录合成cDNA20ul体系的，我直接用纯水稀释到200ul。 SYBR荧光染料qPCR实验就找上海融享生物科技有限公司。贵州TaqMan荧光探针qPCR公司电话
qPCR的好处有些什么？山西SYBRGreen法qPCR机构
负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。山西SYBRGreen法qPCR机构
