做RT-qPCR实验时，大家常常会遇到各种各样的问题，如扩增曲线异常，熔解曲线异常，复孔重复性差，Ct值偏大等，其中Ct值偏大可能是大家较容易遇到的问题。现在就给大家分享下，遇到Ct值偏大问题时该如何解决。RT-qPCR的Ct值偏大主要有两种情况，一种是所有基因Ct都偏大，另外一种是个别基因Ct偏大。所有基因Ct偏大：如果前期所做基因均已做过预实验，Ct值正常，而本次实验，所有基因扩增Ct值都偏大，那很可能是模板质量的原因，如发生了降解，浓度不纯等。可通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳实验评估RNA的质量，包括浓度、纯度及完整度。SYBR荧光染料qPCR机构哪家靠谱？云南实时荧光定量qPCR公司哪里有
除了RT-qPCR实验上面所提到的非反转录控制外，所有qPCR反应还需要更多的控制和/或量化标准。在SYBRGreenI反应中应当用探针区别预期PCR产物中区别不可预知的扩增产物(如引物二聚体)时，应用NTCs检测PCR污染。NTCs应当包含在每个板或者批样品中，并建立拒绝条件。如果Cq值未知比较高值为35，那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。从实验样本中提取的核酸的阳性对照可用于监测实验随时间变化，并且当每次操作不执行校准曲线时阳性对照就必不可少。上海TaqMan荧光探针qPCR机构哪家好qPCR 是分子生物学中的常规实验。
DNA样本：一般情况下DNA降解比较少，但是法医学评价外源性DNA降解是重要的，如恶劣环境犯罪或者大规模灾害，或者涉及失踪人员案件中，DNA化学结构可能出现降解。qPCR扩增片段大小可以帮助减少测定有关的问题，但是开发供DNA质量的定量检测方法可用于这种特殊用途。可能的抑制剂是更普遍可变因素，必须在发表中指出，没有抑制剂纯化的DNA可能会扭曲结果，比如病原体的检测和量化。虽然可以添加样本与阳性对照来检测抑制剂，但是不同的PCR反应可能会受抑制剂影响。因此比较好是常规使用核酸稀释来证明Cqs或拷贝数的减少是与预期结果一致的。
1、SYBRGreen在高浓度情况下会抑制PCR反应，但普通的qPCR2×Mix是不会出现这样的情况；2、蛋白的检测确实可以说明表达的问题，泛素化、磷酸化也能检测蛋白的作用，其实检测mRNA也能解决大部分的表达问题，蛋白表达一般是在mRNA表达差异不明显的情况下再使用的；3、芯片是高大上的，但单基因变化，完全用不上基因芯片，而且在做基因芯片之前，也需要在有表达差异的细胞或者组织间进行；4、二代测序是更高大上的技术，深度测序可以了解低频的突变，转录本的测序可以了解细胞组织的整体的表达情况，要是你只是检测单基因完全没必要搞得那么复杂；5、当实验室的师兄，特别是表面上很有科研能力的师兄怂恿你用新技术的时候，请千万要三思而行，自己思考一下才会省去很多不必要的麻烦；6、记得给老板省点钱，不然小伙伴们不好交差，倘诺自己是老板的小伙伴，自己的经费更要省着花才对。 上海SYBR荧光染料qPCR机构哪家靠谱？
因此大量有关qPCR发表的文献中存在结果证据不足甚至是相互矛盾的结果，这对科学研究是一个很大的危险。科学文献的发表和撤回也为人们提出了警示。多数研究报告缺少足够的信息加剧了这个问题，使用qPCR的文献没有提供足够的实验细节，可以让读者评估结果的质量或者重复实验。具体表现为样本的采集和处理信息，RNA质量和完整性，反向转录细节，PCR效率，以及分析参数等等，这些信息常常被忽略，然而样本正规化是反对没有价值的单一参考基因。相对定量qPCR实验就找上海融享生物科技有限公司。广西实时荧光定量qPCR电话
上海融享生物科技有限公司SYBRGreen法qPCR服务。云南实时荧光定量qPCR公司哪里有
qPCR有两化学方法——探针法和染料法，这位童鞋选择的是相对便宜的SYBR green染料法。但是偏有好事之徒指点江山，“为啥要做SYBRgreen染料法的qPCR呢？要做定量qPCR的话，不如做Taqman探针法的qPCR来得精确。有文章介绍过，SYBRgreen来做qPCR的话，是会有很严重问题的。因为SYBRgreen会抑制PCR反应，得出来的结果没有探针来的效果好，其实价钱也没差很多！”这位临床高手+实验室菜鸟，在他人的建议之下，开始转向研究Taqman探针，好不容易摸出点门道，准备将Taqman探针发给公司合成。实验室又出现另一个“好事之徒”，建议其直接检测乳腺疾病MCF-7细胞系Pim3蛋白表达量，理由如下：mRNA表达降低，并不表示蛋白表达会降低呢，因为如果蛋白的泛素化停滞，蛋白就会累积；又或者蛋白的磷酸化不断活跃，也会导致蛋白作用的变化。所以用Taqman探针还不如用WesternBlot来得直接，直接检测蛋白表达、磷酸化、泛素化的变化，以防后患。抗体的价钱也就比Taqman探针贵了那么一点而己。云南实时荧光定量qPCR公司哪里有
