Ct值与模板拷贝数的关系：理想情况下，qPCR的模板经过一定的循环数进行指数扩增，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量Cn=起始模板量C1×（1+扩增效率E）^循环数n。但是由于E通常无法达到100%，并且在扩增的后期，扩增效率会逐渐降低，只有在理想的情况下才满足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始浓度差2倍。由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。这是目前较常用的qPCR定量的方法，即用已知浓度的标准品与未知浓度样品同时扩增，将未知浓度样品的Ct值代入该标准曲线获得未知样品浓度。分析定量时，一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量结果的不准确。标准曲线需满足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10。同时定量标准品的量值需要准确可靠。用qPCR进行定量，理论上可行，实际上很难获得准确的定量结果。qPCR的优势有些什么？广东TaqMan荧光探针qPCR
想做好qPCR，show出漂亮的结果，纠正不良的qPCR操作习惯，需要准备以下内容（以染料掺入法为例子）。1.设计目的基因引物。请参考以上内容，上海英俊默认是2OD，实际上2OD~5OD的价格是一样的，5OD做几千个样品是没问题的，我每次都是设计5OD，1OD/管，每次只溶解1管，其余4管冻存-80，理论上管用n年2.设计内参基因引物。这很重要，不同组织选择内参基因种类不同，常见内参有HPRT、ACTIN、UBC、UBB等等，不要人云亦云，自己去找文献看看目的组织内哪种内参较稳定，有钱的，需要数据可靠性高的，可以选择2种引物，更高大上的可以做3种及以上，然后利用qbaseplus选择较稳定的引物。3.准备一瓶灭菌超纯水用来稀释引物。虽然以前都说用TE缓冲液，但是qPCR还是用纯水的好，加多少水到10umol都是告诉你的，请自觉寻找。4.在A工作区域内分装引物，加入灭菌水后，摇晃-10000rpm1分钟-分装40ul/管，我每次都是把上下游引物混在一起分装，这样比较方便，冻存后，每次用之前冰上溶解。5.在B工作区域内准备模版，cDNA或者DNA，总之，1ugRNA，经逆转录合成cDNA20ul体系的，我直接用纯水稀释到200ul。 辽宁SYBRGreen法qPCR做 qPCR,不要钻进唯Ct值的牛角尖。
即使操作如此简单，很多实验者仍然会轻视。在此建议，将温度梯度优化纳入到预实验环节中，通过qPCR的温度梯度方法确认比较好的Ta值。还要提醒大家，软件预测的引物和探针的Ta值只用于参考，而且比较好Ta值会随着反应环境的变化而变化，预测的准确度并没有预期的那么高，因此不能盲目迷信，比较好的Ta值仍然要通过实验证据来确认。扩增子、探针和引物：说完退火温度，再来聊聊扩增子的选取、探针和引物的设计，这也是扩增效率的重要影响因素。
LOD为检测到阳性样本比较低浓度为95%。换句话说，包含一组靶基因复制内LOD的浓度较多不超过5%失败反应。低拷贝PCRs是随机有限的，不可能出现LODs为3个拷贝/PCR。如果是多个反应，可通过数字PCR得到低浓度的准确定量。实际上浓度校准器可以通过检测有限的稀释，失败和成功反应的百分比符合Poisson分布。很多因素可以解释qPCR结果的变异，包括温度的差异可影响退炎和/或变性，浓度不同可由移液浓度错误引起，以及随机变异。qPCR精度的一般随着拷贝数减少而变化。理想状态是实验内变异(重复性)在图中应当表现为标准误，或者重复样本的在校准曲线作为CIs。CVs不能用作Cqs，但是可用于表达拷贝数或浓度的变化。这种技术上的变化应该有别于生物变异。生物复制可直接解决不同组或救治组之间的qPCR结果的统计学差异。诊断分析，报道不同部位和不同操作者之较批间精度(重复性)可能同样是必须的。SYBRGreen法qPCR机构哪家靠谱？
定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。计算相对于基准样品（Calibrator）的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。为什么我的qPCR每次结果都不太一样？广东SYBR荧光染料qPCR公司哪家好
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1、SYBRGreen在高浓度情况下会抑制PCR反应，但普通的qPCR2×Mix是不会出现这样的情况；2、蛋白的检测确实可以说明表达的问题，泛素化、磷酸化也能检测蛋白的作用，其实检测mRNA也能解决大部分的表达问题，蛋白表达一般是在mRNA表达差异不明显的情况下再使用的；3、芯片是高大上的，但单基因变化，完全用不上基因芯片，而且在做基因芯片之前，也需要在有表达差异的细胞或者组织间进行；4、二代测序是更高大上的技术，深度测序可以了解低频的突变，转录本的测序可以了解细胞组织的整体的表达情况，要是你只是检测单基因完全没必要搞得那么复杂；5、当实验室的师兄，特别是表面上很有科研能力的师兄怂恿你用新技术的时候，请千万要三思而行，自己思考一下才会省去很多不必要的麻烦；6、记得给老板省点钱，不然小伙伴们不好交差，倘诺自己是老板的小伙伴，自己的经费更要省着花才对。 广东TaqMan荧光探针qPCR
